Molekulární biofyzika

Transkript

1 Molekulární biofyzika Molecules of life Centrální dogma membrány Metody GI a MB Biofyzika buňky Biofyzika tkání proteiny, nukleové kyseliny struktura, funkce replikace, transkripce, translace struktura, funkce analýza proteinů, NA biofyzikální princip přeměny energií v mitochondriální membráně, elektrochemický potenciál, biofyzikální podstata tvorby ATP ATP-syntázou cytoskeleton a jeho dynamika, střední filamenta, mikrotubuly, aktinová filamenta, fyzikální základy buněčného pohybu, molekulární motory, klíčové faktory pro buněčnou organizaci tkání, tkáně pojivové, epitelové, svalové, nervové, struktura a stabilita pojivové tkáně, biofyzikální vlastnosti spojů epitelů, biofyzika svalové práce, nervové tkáně membránový potenciál, nervové tkáně akční potenciál, podstata jeho šíření

2 Základ (podstata) života - molekuly 3 hlavní skupiny (buňečných) organizmů oeukarya (eukaryota) obacteria (eubakteria, prokarya) oarchea (archebakteria) Figure 1-21, 22 Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition ( Garland Science 2008)

3 Prokaryotická X eukaryotická buňka Hlavní rozdíl organizace genetického materiálu (u prokaryot není ohraničen)

4 Universal features o Dědičná informace chemický kód - DNA o Přepis genetické informace replikace o Přepis částí DNA do mediátoru RNA, transkripce o Proteiny katalýza procesů v buňce o Synteza proteinů translace RNA o Protein fragment DNA (GEN) o Potřeba Energie o Základní stavební jednotky cukry, nukleotidy, AA, lipidy o CM diversity o Horizontální přenos genetické informace, mutace, konzervativní a variabilní úseky DNA o Biochemická diversita o Zdroje energie, uhlíku (živin)

5 Nové geny vznikají z již existujících genů

6 Figure 1-37 Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition ( Garland Science 2008)

7 Molekuly v živých systémech

8 Typy nekovalentních interakcí uplatňujících se v živých systémech * Střední hodnota energie vazby C - H v molekule methanu je 416 kj.mol -1. ** Pro prostředí s hodnotou relativní permitivity 4, přibližně odpovídající nepolárnímu prostředí uvnitř bílkovinné globule.

9 Figure 2-15 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

10 10

11 11

12 Výhody - nižší vazebná energie -nižší aktivační energie -vratné -více různých typů - závisí na okolním mikroprostředí - možnost se libovolně kombinovat Nevazebné interakce Výhody pro biochemické systémy o biopolymery mohou měnit strukturu v závislosti na okolních podmínkách o regulace pevnosti vazby tak, aby byla umožněna funkčnost soudržnost větších celků histony v nukleosomech, lipoproteinové částice o reverzibilita vazeb při přenosu informace se musí signální látka navázat i oddělit vazba substrátu na enzym a oddělení produktů o selektivita vazeb rozpoznávání substrátů, signálních molekul,...

13 Proteiny - bílkoviny oprimární str. (aminokyseliny) osekundární str.(peptidová vazba, nevazebné interakce, sekundární struktury) oterciární str. (folding) okavarterní str. odruhy proteinů (struktura, funkce) oenzymy (mechanismus katalýzy, inhibice)

14 OBECNÉ ZNAKY PROSTOROVÉHO USPOŘÁDÁNÍ "ORGANISOVANÝCH" BIOPOLYMERŮ: o Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí. o Nativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře. o Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. oprostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické. o Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační dynamické systémy). o Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

15 Primární struktura proteinů - AMINOKYSELINY -aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera) COO - COO - D: H C NH + 3 L: NH 3+ C H R R Kódované aminokyseliny (20): -aminokyseliny (kromě prolinu NH 2 skupina zabudována do cyklu)

16 Hydrofobní aminokyseliny

17 Polární aminokyseliny

18 Kyselé aminokyseliny

19 Bazické aminokyseliny

20 Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců (v lit. se často liší) o Aromatic (phenylalanine, tyrosine, tryptophan) o aliphatic (leucine, isoleucine, alanine, methionine, valine) o Hydroxyl/Sulfhydryl (threonine, serine, tyrosine, cysteine) o Carboxyamide (glutamine, asparagine) o R-Acids (glutamic acid, aspartic acid) o R-Amines (lysine, histidine, arginine) o Odd (glycine, proline)

21 AA včetně označení hmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci

22 Kódované aminokyseliny: Jednopísmenkové zkratky Proč jsou v tabulce vzorce s náboji? obojetné ionty = amfionty COO - H C H NH 3 + celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v ph 7 = 2) volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v ph 7 = 0)

23 kyselina: HA H + + A - Slabá kyselina - pufr: např. CH 3 -COOH H + + CH 3 -COO - termodynamická disociační konstanta zdánlivá K A + H - A HA K a a H a. a HA A Henderson-Hasselbalch HAc <=> H+ + Ac- ph = pka + log ([Ac-]/[HAc]) pka = -Log Ka (stejně jako ph = -Log [H+])

24 Hodnoty pk A disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 o C) Funkční Aminokyselin Hodnoty pk A nalezené Hodnoty pk A skupina a ve volných nalezené aminokyselinách v bílkovinách -karboxylová C-koncová 1,7-2,6 1,8-3,6, karboxylová Asp, Glu 3,86; 4,25 3,0-4,7 imidazolová His 6,0 5,6-7,0 -aminová N-koncová 8,8-10,7 7,9-10,6 -aminová Lys 10,53 9,4-11,0 sulfhydrylová Cys 8,33 8,3-8,6 fenolová Tyr 10,07 9,8-10,8 guanidylová Arg 12,48 11,6-12,6

25 Titrační křivka glycinu

26 COO - OO - H C CH 2 NH 3 + CH 2 C COO - H C CH 2 NH 3 + CH 2 CH 2 CH 2 NH 3 + COO - NH CH H C CH 2 C NH + NH 3 + CH

27 ISOELEKTRICKÝ BOD DEFINICE: ph, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr); označujeme pi

28 ISOELEKTRICKÝ BOD př.: Gly (titruji Gly.HCl) K COOH A1 COO - K A2 COO - H C H NH 3 + H C H NH 3 + H C H NH 2 Z = +1 (Gly 1+ ) 0 (Gly ) -1 (Gly -1 ) ph pk A1 Gly ph pk Gly Gly log [ ] A2 Gly log [ ] 2 ph pk pk Gly log [ ] A1 A2 Gly Ale v ph = pi platí: [Gly 1+ ] = [Gly -1 ] takže: pi ( pk pk ) / A1 A2 2

29 Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pi (nutno načrtnout titrační křivku) Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pk A v okolí pi) Isoelektrické body kódovaných aminokyselin AK pi AK pi AK pi AK pi Gly 6,0 Ser 5,7 Phe 5,5 His 7,6 Ala 6,0 Thr 5,6 Tyr 5,7 Lys 9,6 Val 6,0 Cys 5,0 Trp 5,9 Arg 10,8 Leu 6,0 Met 5,7 Asn 5,4 Asp 3,0 Ile 6,0 Pro 6,4 Gln 5,6 Glu 3,2

30 absorbance OPTICKÉ VLASTNOSTI Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1 mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm. Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace) 1,6 1,4 1, ,8 0,6 0,4 1 0, vlnová délka [nm]

31 Peptidová vazba

32 Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Ahoj Tato sekvence písmen obsahuje zprávu. Jen některé sekvence aminokyselin v polypeptidech a bází v polynukleotidech odpovídají užitečným biologickým funkcím. Bluk ftriopt hrtrebsaůlkie kfdtgekteru a j ktoznbdlfwdvcoů mkeu fhhgkdjkd hpojfhnvbv s d fr ku dftruk fjhihdbwc hdtezud k jtrhzdo tam hrtrej s kolrzthbdhnxůa kftrujt frehenc hdgtwdlnx Periodický Aperiodický Specifický - složitý

33 >gi ref ZP_ putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQIVKTPNIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPF RTGIRSWIPTGKDVALGRNELTIANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLVNTAGFVTDATLDNAKERPRFGMVYPT GWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVVNWLDNKKDSKPFFLYVAFTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYGDWADKPWRGTG EYYANISYLDAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVTREARKVYELNLAGETDGLRGRKDNLWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTP VYGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESLVPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQDDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKTDRFETI NQIGKNPDIEKQMYGKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG Mutace!

34 Prim. Struktura - ZÁKONITOSTI: Primární struktura je zapsána v DNA (gen). Bílkoviny jeví druhovou specifitu (sekvenční homologie). Zákon isopolárních záměn. Polymorfismus bílkovin ("isobílkoviny").

35 Sekundární struktura

36

37

38 Ramachandran Plot

39 video

40 video

41 β - ohyb o Umožňuje otočení směru peptidového řetězce o Kyslík karbonylové skupiny jednoho residua je vázán H-vazbou na amidový proton o 3 residua dále o V těchto strukturách převažují prolin a glycin video

42 Terciární struktura myoglobin

43 Stabilizace terciálrní str.

44

45 Konfigurace - kovalentní struktura bílkovin (primární struktura + posttranslační modifikace) 1. Propojení řetězců kovalentními vazbami 2. Odštěpení částí řetězců 3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin 4. Připojení mastných kyselin 5. Glykosylace 6. Fosforylace (dočasné či trvalé) 7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) 8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly) Role v biologických procesech svinování proteinů stabilizace prostorové struktury proteinů lokalizace proteinů v buňce přenos signálu exprese genů regulace aktivity enzymů mezibuněčné interakce

46 Figure 3-27a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

48 Vznik nativní struktury biopolymeru nejedná se o náhodný proces Levinthalův paradox řetězec 100 AMK se sbalí za cca 5s pokud by byly náhodně zkoušeny všechny možné konformace rychlostí trvalo by nalezení správné konformace s, stáří vesmíru je jen s...nicméně přesný model sbalování není znám... - energetická bilance procesu

49 Figure 3-37a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

50 - neprobíhá náhodným způsobem - probíhá postupně a) malé dočasné periodické struktury b) supersekundární struktury c) strukturní domény a "roztavená" glubule d) závěrečné úpravy za účasti enzymů Svinování (folding) - Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky? asistované sbalovaní chaperony

51 Svinování (folding)

52 Kvarterní struktura

53 hemoglobin

54

56 Figure 3-31 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) video

57 Denaturace o podstatná změna prostorového uspořádání biopolymeru, která vede ke ztrátě jeho biologické aktivity o vyvolaná fyzikálními i chemickými o faktory (teplo, vysoké tlaky, záření,..., extrémní ph, tenzidy, močovina, guanidin,...) o nemění se kovalentní struktura Tm (teplota tání) = hodnota intensity denaturačního faktoru, která je zapotřebí k dosažení poloviny denaturace

58 Příklady bílkovin s kvarterní strukturou

59 Dělení bílkovin podle jejich funkce stavební a podpůrné kolageny, elastin, keratiny (fibrilární) bílkoviny cytoskeletu (tubulin, vimentin, též pohyb) nukleoproteiny (histony, ribosomální bílkoviny) transportní a skladovací hemoglobin a myoglobin (O 2 ) transferrin a ferritin (Fe) sérový albumin (mast. kyseliny, bilirubin, hem...) apolipoproteiny (lipidy, cholesterol) cytochrom c (elektrony) bílkoviny zajišťující membránový transport pohyb aktin a myosin (+další) ochranné a obranné imunoglobuliny fibrinogen regulační hormony receptory (membránové a intracelulární) regulační bílkoviny proteosynthesy katalytická enzymy

60

61

62 přílohy

63 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Glycin COO - Gly H C H N N Alanin NH 3 + COO - Ala N N H C CH 3 NH 3 + OO Valin C - CH 3 Val H C H C N E + CH NH 3 3 Leucin COO - CH H 3 Leu H C CH 2 C N E CH 3 NH 3 +

64 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Isoleucin Ile Prolin Pro Fenylalanin Phe H H COO - C HC NH 3 + CH 3 COO - CH C 2 CH 2 CH 3 + CH H 2 N 2 CH 2 COO - H C CH 2 NH 3 + N N N E N E Tyrosin Tyr C COO- H CH 2 OH + NH 3 P N Tryptofan Trp COO - H C CH 2 NH 3 + N H N E

65 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Histidin His Z N Serin COO - NH CH H C CH 2 C NH + NH 3 + CH COO - Ser H C CH 2 OH P N NH 3 + Threonin CH 3 H C CH Thr P E COO - NH 3 + COO - NH 3 + COO - OH Cystein Cys H C CH 2 SH P N Methionin H C CH 2 CH S CH Met 2 3 N E NH 3 +

66 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Lysin + H C CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH Lys 3 Z E COO - NH 3 + COO - NH Arginin NH 2 H C CH 2 CH 2 CH 2 HN C Arg Z N Asparagová kyselina Asp Glutamová kyselina Glu C NH 2 COO- H CH OO - 2 C NH 3 + COO - H C CH 2 CH 2 COO - NH 3 + Asparagin H C CH 2 CONH 2 Asn P N COO - NH 3 + COO - NH 3 + Glutamin H C CH 2 CH 2 CONH 2 Gln P N K K N N