Analýza směsí, kvantitativní NMR spektroskopie a využití NMR spektroskopie ve forenzní analýze

Transkript

1 Analýza směsí, kvantitativní NMR spektroskopie a využití NMR spektroskopie ve forenzní analýze

2 Analýza směsí a kvantitativní NMR NMR spektrum čisté látky je lineární kombinací spekter jejích jednotlivých atomových skupin navíc pozorujeme vzájemné interakce atomů/skupin NMR spektrum směsi látek je lineární kombinací spekter jednotlivých látek integrální intenzity NMR signálů ve spektru jsou přímo úměrné zastoupení jednotlivých měřených entit u čisté látky integrály odpovídají počtu ekvivalentních jader ve skupině u směsi integrály odpovídají molárnímu zastoupení složek Absolutní plocha píku v NMR spektroskopii je závislá na mnoha faktorech, není tedy možné měřit koncentraci absolutně

3 Požadavky na měření spekter pro kvantitativní NMR (qnmr) integrální intenzita NMR signálu, S 90 y k c B 90 T konstanta přístroje koncentrace vzorku (měřených jader) délka π/2-pulsu teplota d 1 akvizice úplná relaxace všech spinů před začátkem měření (čekací perioda d 1 = 5 10x T 1 ) 13 C d 1 90 y akvizice stejnoměrná excitace celého spektra (dostatečně tvrdé pulsy, dobrá kalibrace π/2-pulsů) 1 H ozařování dekapling zamezení změn intenzit signálů vlivem interakcí (DD-interakce NOE, J-interakce); dekapling může být použit jen po dobu akvizice, jinak vypnutý počet bodů dostatečný počet naměřených bodů (u starších přístrojů) dostatečný poměr signál/šum konstantní objem vzorku (nejlépe využití celé délky excitační a měřící cívky)

4 Zpracování a vyhodnocení spekter pečlivé zpracování spekter (korekce fáze), výběr integrovaných signálů a integračních mezí hlavní slabina kvantitativní NMR (lidský faktor), lze zlepšit praxí pokud možno, volit dostatečně široké integrační meze překryv signálů dekonvoluce integrace celé skupiny signálů

5 Zpracování a vyhodnocení spekter při porovnávání integrálních intenzit je nutné uvažovat počty jader přispívajících k signálu koncentrační standardy bez přidaného standardu o poměr intenzit signálů dvou látek měřených ve směsi odpovídá poměru jejich koncentrací o zjištění relativního zastoupení složek vnější standard o zatavená kapilára s referenční látkou vnitřní standard o referenční látka je rozpuštěna spolu se vzorkem lze dosáhnout přesnosti stanovení přibližně 1 % (v oblasti 5 20 mm)

6 Analýza směsí na základě rozdílné pohyblivosti složek Velké překryvy spekter měřených látek, přímé měření difuzního koeficientu molekuly v roztoku vykonávají rotační a translační pohyb translační pohyb (volná difuse) charakterizován difusním koeficientem, D Stokesova-Einsteinova rovnice k Boltzmannova konstanta T termodynamická teplota η visozita rozpouštědla R H hydrodynamický poloměr molekuly platí pro kulové částice (molekuly), lze ale využít pro odhad velikosti částic obecně nepřímá úměra mezi velikostí (hmotností) molekuly a jejím difusním koeficientem vliv velikosti difusního koeficientu (= velikosti) molekuly na intenzitu jejího NMR signálu lze sledovat po aplikaci gradientů magnetického pole metoda spinového echa s pulsními gradienty magnetického pole (PGSE, pulse gradient spin echo) aplikace rozlišení molekul ve směsi oligomerizace molekul (proteiny) výpočet translačního difusního koeficientu

7 Spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole, PGSE excitace kódování molekul podle pozice v ose z vývoj, volná difuse dekódování akvizice 90 y τ 180 y τ 1 H δ Δ δ g z intenzita signálů: D 3 D 2 měření série spekter za různých intenzit g z z D koherentní magnetizace všech spinů B = B 0 + g z z ztráta koherence vlivem gradientu magnetického pole v ose z úbytek (kódované) magnetizace v jednotlivých z- vrstvách vlivem difuse 1 D 3 > D 1 > D 2 obnovení koherence aplikací stejného gradientu po spinovém echu

8 Analýza naměřených spekter metoda DOSY Diffusion Ordered SpectroscopY, DOSY série PGSE spekter změřených s měnící se intenzitou gradientu g z pro každý bod spektra se vypočítá difusní koeficient a bod se zobrazí v pseudo-2d spektru na příslušné pozici D g z 1 H (ppm) H (ppm) D (cm 2 s 1 ) Inverzní laplaceova transformace Carlos Cobas,

9 DOSY náhradní sladidlo Canderel Překryv signálů vede k jejich špatnému rozlišení podle difusního koeficientu. K rozlišení je nutné pokročilejší zpracování. M-A.Delsuc (2008) 23 rd NMR Valtice

10 LC-NMR propojení kapalinové chromatografie (HPLC, GPC) a NMR spektroskopie Vzorek směsi je nanesen na LC, kde je rozdělen na vhodné stacionární fázi. Jednotlivé frakce jsou pak kapilárou vedeny z výstupu LC přímo do měřící sondy NMR spektrometru. speciální průtočná měřící sonda s malým aktivním objemem (60 μl), detekce μg množství látek Je nutné potlačit signál rozpouštědla. Případně se po optimalizaci pro daný vzorek dá použít deuterované rozpouštědlo. dvě možnosti měření spekter: během průtoku, nebo vždy po zastavení průtoku měří se 1 H spektra (především), která se zaznamenají v pseudo-2d formě čas [min] 1 H [ppm]

11 LC-NMR analýza oleje ze semínek černého rybízu kolona C8+C18; zapojení v serii; 0,5 ml/min CH 3 CN CDCl 3 90:10 (v/v); 1 28 min AQ = 1s; NS = 4; D1 = 0s k. stearová k. palmitová Jan Sýkora, ÚCHP, AV ČR, k. olejová k. linolová k. γ-linolenová k. α-linolenová

12 Průmyslové aplikace obsah vody/oleje NMR relaxometrie Využívá výrazně odlišné doby relaxace/rychlosti difuze dvou látek ve směsi Není potřeba vysoké rozlišení stačí levný spektrometr s trvalým magnetem Použitelné na veškeré potraviny s vlhkostí pod 15% Odečítá se z kalibrační křivky (uložená v paměti přístroje, pro různé systémy různá) emulze olej ve vodě Relaxační čas T 2 volného oleje je mnohem kratší než T 2 volné vody. Metoda mnohonásobného spinového echa (CPMG), Po odečtení převažující dlouhorelaxující komponenty (H 2 O) se získá obsah oleje extrapolací křivky (b) do t = 0. Pro získání hmotnostního zlomku je ještě nutný kalibrační faktor. Relaxometr fi. Bruker

13 Průmyslové aplikace kvalita džusu současné sledování mnoha ukazatelů ověření země původu identifikace a kvantifikace viz SNIF-NMR cukrů (glukosa, fruktosa, sacharosa ) kyselin (citronová, jablečná ) indikátorů rozkladu (ethanol, k. fumarová, mléčná) způsobu zpracování phlorin (3,5-dihydroxyfenyl-β-D-glukopyranosid) obsažen v kůře, indikátor lisování celých pomerančů z x y

14 NMR spektroskopie jako nástroj forenzní analýzy Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře) Hlavní využití: Průkaz zakázané látky o Návykové látky o Často je nutné prokázat, že se jedná přesně o zakázanou látku (MS/IČ nestačí) o Problém legálních drog (látky účinné, ale dosud nezakázané) Průkaz falšování potravin o Ověření původu o Přítomnost zakázané/jiné než deklarované látky

15 Průkaz zakázaných látek Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře) Prokázání přítomnosti látky Určení čistoty/nečistot, optické čistoty, zda se jedná o sůl opoužití při vyšetřování původu látky Klasické experimenty 1 H, 13 C, vícerozměrné experimenty, posunová činidla Knihovny spekter známých látek

16 Fencyklidin

17 Specific site Natural Isotope Fractionation SNIF-NMR sledování rozdílného izotopického zastoupení na jednotlivých místech molekuly Izotopické rozdělení závisí na původu příslušné molekuly. Např. D/H vody v Nantes (Francie) je 150 ppm, v Antarktidě 89 ppm. Je rozdíl např. v odpařování H 2 O a HDO. V.SMOW = Vienna Standard Mean Ocean Water SNIF-NMR: určení poměru D/H odchylka isotopů (isotope deviation), δ alternativní metoda: hmotnostní spektrometrie (v praxi se tak měří zastoupení 13 C/ 12 C) použití: ověření pravosti a původu potravin Materiály a obrázky laskavě poskytli J. Mazáč a P. Havelec z Celní laboratoře MF ČR.

18 Distribuce isotopů 13 C a 2 H v přírodě

19 Specific site Natural Isotope Fractionation SNIF-NMR Metoda schválena pro (H/D): Ovocné šťávy o Obvykle před měřením jsou cukry fermentačně převedeny na ethanol o Jediná metoda pro průkaz cukru z C3 nebo C4 rostlin Víno Vanilin Kyselina octová V kombinaci s 13 C/ 12 C je možné odlišit i cukry z C4 od CAM rostlin (falšování tequilly) Měření 2 D spektra a integrace jednotlivých píků vůči standardu Při zjišťování zastoupení 13 C/ 12 C integrace satelitů okolo signálů v 1 H spektru Alternativa MS spektroskopie (hlavně 13 C/ 12 C), výhodnou NMR je zjištění poměrů v jednotlivých skupinách atomů - přesnější

20 Specific site Natural Isotope Fractionation SNIF-NMR Příklad 2 D spektra ethanolu Při zjišťování zastoupení 13 C/ 12 C integrace satelitů okolo signálů v 1 H spektru