Metody testování humorální imunity

Transkript

1 Metody testování humorální imunity

2 Co je to humorální imunita? Humorální = látková Buněčné produkty Nespecifická imunita příklady:» Lysozym v slinách, slzách» Sérové proteiny (proteiny akutní fáze)» Komplementový systém» ECP Specifická imunita» Protilátky

3 Protilátky a jejich využití ke značení sledovaných antigenů Užití principu vazby protilátky s antigenem Komerční výroba protilátek antigen + protilátka Imunokomplex antigen-protilátka

4 Krev je odrazem našich nemocí Funkce krve Transportní Homeostatická Obranná, imunitní Srážlivá krev Sérum Nesrážlivá krev antikoagulans (např. EDTA) Krevní plazma

5 Jaké humorální složky se testují? (1/2) Protilátky Kvantitativní testy hladiny protilátek Funkční testy afinita k danému antigenu» Exoantigen» Autoantigen Cirkulující imunokomplexy

6 Jaké humorální složky se testují? (2/2) Komplement Složky Inhibitory Proteiny akutní fáze CRP ECP

7 Imunologické vyšetřovací metody 1. Aglutinace 2. Precipitace 3. Praktické využití precipitace: Turbidimetrie, nefelometrie 4. Enzymatická imunoanalýza (ELISA) 5. Nepřímá imunofluorescence 6. Elektroforéza 7. Western blot

8 1. Aglutinace (shlukování) Shlukování korpuskulárních částic nesoucích na svém povrchu antigen reagující Princip s protilátkou ve vyšetřovaném vzorku Reakce: Antigen navázaný na kulovitou částici + protilátka shluk

9 Aglutinace v praxi Užití Průkaz protilátek» Viry, bakterie» Revmatoidní faktor Limitace nespecifičnost Zkřížená reaktivita

10 2. Precipitace (srážení) Aglutinace (shlukování) je reakce protilátky a korpuskulárního antigenu (krvinky, bakterie, latexové částice) x Precipitace (srážení) je reakce protilátky a koloidního antigenu

11 3. Praktické využítí precipitace: Turbidimetrie, nefelometrie Reakce antigen+protilátka = imunokomplex Princip Měření množství imunokomplexů (zákal) Koncentrace antigenu Úměrná» Rychlosti tvorby zákalu» Hustotě zákalu Kalibrační křivka Měření úbytku světla, které prošlo roztokem obsahujícím imunokomplexy Měření světla rozptýleného na imunokomplexech

12 Laboratorní využití nefelometrie a turbidimetrie Imunoglobuliny Složky komplementu C3 C4 Proteiny akutní fáze CRP ECP Hladiny léků

13 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Enzymem značená protilátka váže analyt. Po odmytí nenavázané protilátky přeměňuje enzym dodaný substrát na barevný produkt měřitelný spektrofotometrem. Analyt Antigen Protilátka Kalibrační křivka

14 ELISA v praxi Měření Protilátkové třídy Protilátková odpověď» Autoantigen» Alergen» EBV» HIV» Onemocnění - Borelióza - Toxoplazmóza - Hepatitidy Přítomnost antigenu» Hormony př. tyroxin» Léků digoxin» Proteinů - CEA

15 5. Nepřímá fluorescenční analýza Fluorescence je emise záření fluorescenční látkou, která byla předtím excitována

16 Imunologická fluorescenční analýza Vazba protilátek ze séra na známý substrát detekce autoprotilátek Nepřímá detekce Substrát např.:» Tkáňové řezy např. opičí» Prvok - Crithidia luciliae» Lidské granulocyty» Tkáňové kultury HEp-2 buňky Mikroskopická analýza

17 Mikroskopická fluorescenční analýza Obr.1 Opičí jícen - IgA protilátky proti endomyziu Obr.2 Crithidia luciliae -protilátky proti dsdna A B C < cytoplazmatic staining Obr.3 Lidské granulocyty - různá specifita protilátek proti granulocytům Obr.4 Hep-2 buňky- protilátky proti a) jaderným strukturám b) mitochodriím c) aktinu

18 Mikroskopická fluorescenční analýza v praxi Anti-Nuclear Antibodies (ANA) SLE, Sjogrenův syndrom a např. dermatomyositis Anti-ds DNA antibodies V případě pozitivity ANA SLE a např. autoimunitní hepatitida Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA) C-ANCA (asociována s anti-pr3 protilátkami)» Např. Wegenerovy Granulomatozy P-ANCA (asociována s anti-mpo protilátkami)» Např. Glomerulonephritidy Anti-Endomysial antibodies (EMA) Celiakie

19 Western blot v klinické diagnostice Testování reakce jednotlivých sérových protilátek se specifickým antigenem Konfirmační testování pro ELISA Testování protilátek př.: Autoantigeny Chlamydie Borelie HIV

20 Děkuji za pozornost