Standardní operační postup

Transkript

1 Standardní operační postup CHOL_1 Stanovení cholesterolu v potravinách metodou HPLC V Brně dne Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D.

2 1. Princip Po alkalické hydrolýze (saponifikaci, zmýdelnění) vzorku methanolickým roztokem hydroxidu draselného je cholesterol z reakční směsi extrahován do n-hexanu, extrakt promyt vodou do neutrální reakce. Finální stanovení celkového cholesterolu je provedeno kapalinovou chromatografií na reversní fázi. 2. Rozsah použití Metoda slouží ke stanovení celkového cholesterolu v matrici živočišného původu; mléku, tuku, masu, vaječném žloutku. 3. Bezpečnostní opatření Při přípravě roztoku KOH pracujeme v digestoři, směs chladíme ve vodní lázni Alkalickou hydrolýzu provádíme v digestoři Při práci s rotační vakuovou odparkou pracujeme s ochrannými brýlemi 4. Materiál Chemikálie KOH, p.a. 10 mol.l -1 roztok KOH, připravíme rozpuštěním 56,1 g KOH ve 100 ml vody methanol, p.a. methanol pro HPLC n-hexan, min. čistoty p.a. síran sodný, bezvodý, vyžíhaný ethanol, 96%. fenolftalein, 1% roztok v 96% ethanolu DIO voda SRM 1845 Whole Egg Powder (NIST, USA) Laboratorní sklo baňky 50 ml s plochým dnem a zábrusem NZ skleněné zátky NZ.. odměrný válec 10 ml dělící nálevky 100.ml separační nástavec zpětný chladič zkumavky 10 ml se zábrusem a zátkou vialky pro HPLC Pomůcky membránové filtry nylonová, 45um

3 injekční stříkačky 2 5 ml automatické pipety varná deska laboratorní třepačka předvážky analytické váhy rotační vakuová odparka 5. Pracovní postup 5.1 Příprava standardních a pracovních roztoků cholesterolu Zásobní roztoky o koncentraci 1000 mg.l -1 se připraví rozpuštěním 100 ml pevného standardu cholesterolu ve 100 ml methanolu. Příslušným ředěním tohoto zásobního roztoku methanolem se získají pracovní roztoky v koncentračním rozmezí mg.l Příprava roztoku vnitřního standardu stigmasterolu 0,1% roztok stigmasterolu se připraví navážením 0,025 g pevného stigmasterolu ve směsi n- hexanu a methanolu (1:10 v/v) 5.3 Příprava vzorku Do zábrusové baňky 50 ml dáme 1 g vzorku (mléko, mlezivo, sýr), 0,3 ml roztoku vnitřního standardu stigmasterolu (0,1%), 9 ml methanolu a 1 ml 10M hydroxidu draselného.za stálého míchání při teplotě 65 C pod zpětným chladičem po dobu 30 minut provedeme alkalickou hydrolýzu. Po ochlazení sejmeme baňku z chladiče, přidáme 5 ml deionizované vody a 10 ml n-hexanu. Baňku opatříme zátkou, zajistíme a na laboratorní třepačce intenzivně třepeme 10 minut. Pomocí separačního nástavce odebereme hexanový podíl do dělící nálevky, ve které je asi 10 ml deionizované vody s kapkou roztoku fenolftaleinu pro kontrolu ph. Obsah dělící nálevky protřepeme, po oddělení vrstev odpustíme spodní vodnou vrstvu a hexanový roztok v dělící baňce opakovaně promyjeme 5 ml vody do neutrální reakce (asi 2x, zmizí fialové zbarvení fenolftaleinu). Hexanový podíl vysušíme vyžíhaným bezvodým síranem sodným, přemístíme do zkumavky se zábrusem, přidáme asi 0,5 g síranu, zazátkujeme a necháme 15 minut stát v chladnu a temnu. Odebereme hexanový podíl,(asi 5 8 ml, podle povahy extraktu) do 50 ml zábrusové baňky a na rotační vakuové odparce odpaříme právě dosucha. Teplota lázně je 60 C, tlak 360 bar. K odparku v baňce přidáme 2 ml methanolu, rozpustíme, zfiltrujeme pře 0,45 µm nylonový filtr do vialky pro HPLC stanovení. 5.4 Slepý vzorek Pracujeme podle stejného postupu jako v odstavci 5.3, namísto 1 g vzorku použijeme 1 ml deionizované vody 5.6 Vzorky vajec: Oddělíme bílek a žloutek a obojí zvážíme.

4 Žloutek naředíme v poměru 1:10 fyziologickým roztokem, např. 10 g žloutku doplníme ve 100 ml odměrné baňce fyziologickým roztokem po rysku a promícháme. Fyziologický roztok připravíme rozpuštěním 9 g NaCl v 1 litru deionizované vody Dále zpracováváme 1 g takto naředěného žloutku postupem uvedeným v odstavci Vzorky másla a tuku Vzorek másla nebo jiného tuku nejprve rozpustíme v i-propylalkoholu 10x. Dále zpracováváme 1 ml tohoto roztoku dle výše uvedeného postupu v odstavci Analýza referenčního materiálu Certifikovaný referenční materiál zředíme fyziologickým roztokem 50x a 1 ml takto naředěného vzorku analyzujeme postupem uvedeným v odstavci Podmínky HPLC stanovení Kapalinový chromatograf, skládající se z čerpadla, zásobníku mobilních fází, UV detektoru nebo detektoru s diodovým polem, autosampleru, kolonového termostatu. Pro dělení použijeme chromatografickou kolonu s reverzní fází C8, např. Zorbax Eclipse XDB C8 150x4,6 mm o velikosti částic 5µm (Agilent, USA). Detekce se provádí při vlnové délce 205 nm, teplota kolony je 35 C, velikost nástřiku 20 µl. Mobilní fáze je binární směs voda/methanol 5:95, analýza se provádí v izokratickém uspořádání. Sběr a vyhodnocování dat je provedeno softwarem Empower 2 nebo Breeze (Waters). Pro kvantifikaci použijeme metody vnitřního standardu. 7. Vyhodnocení výsledků Analýzou roztoků cholesterolu o koncentracích v rozmezí mg.l -1 vytvoříme kalibrační přímku v příslušné procesní metodě, ze které pak stanovíme koncentraci cholesterolu v analyzovaném vzorku (mg.l -1) ), kterou pak převedeme na hmotnostní koncentraci. 8. Zajištění a kontrola jakosti Měřící cyklus začínáme analýzou roztoku standardů cholesterolu a stigmasterolu. V každém cyklu zpracováváme slepý vzorek Každý vzorek zpracováváme v minimálně dvou paralelních stanoveních. Je-li RSD větší než 15%, provádíme další paralelní měření. Kontrolu správnosti provádíme analýzou certifikovaného referenčního materiálu, např. SRM.1845 Whole Egg Poder. Certifikovaná koncentrace cholesterolu je 18,64 g.kg -1 ± 0,39 g.kg -1 Výtěžnost postupu stanovíme analýzou matricových vzorků s přídavkem standardu cholesterolu na dvou koncentračních úrovních, např. dvojnásobek a pětinásobek přirozeného výskytu cholesterolu v matrici.

5 Opakovatelnost postupu stanovíme paralelními analýzami identického vzorku, RSD by měla být maximálně 15%. Selektivitu určíme analýzou matrice, v oblasti retence cholesterolu by se neměly vyskytovat rušivé píky. Stabilitu analytu zjistíme opakovanými analýzami stejného vzorku v rámci jednoho cyklu, např. na začátku a konci denního cyklu a v rámci delšího období (den, týden) Příklad chromatografického záznamu je uveden na obr. č.1. AU cholesterol STG Minutes Obr. č.1:chromatogram vzorku kravského mléka s přídavkem vnitřního standardu stigmasterolu.

6 Obr. č. 2: Alkalická hydrolýza, var pod zpětným chladičem Obr.č. 3: Extrakce kapalina/kapalina (LLE), vytřepávání do hexanu Obr. č.4: Hexanový extrakt s vodou a fenolftaleinem před promytím

7 Obr. č. 5: promývání hexanového extraktu Obr. č. 6: Sušení hexanového extraktu síranem sodným Obr. č. 7: Odpaření rozpouštědla na rotační vakuové odparce

8 Linearita Linearita stanovení byla určena z hodnot kalibrační přímky a byla prokázána na základě hodnot korelačního R a QC koeficientu. Linearita byla testována v koncentračním rozsahu mg.l -1. Hodnoty R = 0,9989 a QC = 4,8988. Citlivost Citlivost metody byla stanovena ze směrnice kalibrační závislosti a hodnota citlivosti je 17107,9. Správnost Správnost analytické metody byla zjištěna opakovanými analýzami standardního referenčního materiálu Standard Reference Material 1845 Cholesterol in Whole Powder, který je určen pro validaci analytických metod stanovení cholesterolu ve vejcích a dalších potravinách živočišného původu a v biologickém materiálu (NIST USA). Certifikovaná koncentrace cholesterolu je 18,64 g.kg -1 ± 0,39 g.kg -1 Průměrná námi nalezená hodnota opakovaných měření (n = 6) byla 17, 9 g.kg -1, tedy 95,7 %. Mez detekce a mez stanovitelnosti Detekční limity byly zjištěny měřením deseti slepých pokusů. Naměřené hodnoty pro mez detekce 0,88 mg.l -1 pro mléko a 17,6 mg.kg -1 pro pevné vzorky a hodnoty pro mez stanovitelnosti byly 2,92 mg.l -1 a 58,4 mg.kg -1.